生物標志物是指能被客觀測量和評價，反應生理或病理過程，以及對暴露或治療干預措施產生生物學效應的指標，對于疾病的鑒定、早期診斷及預防、治療過程中的監控起到幫助作用。糖基化蛋白質組學帶你了解生物標志物研究的良好來源，尿液。

體液樣本比較好取材，更適合biomarker研究。體液樣本中血液是常應用的，血液被認為與機體各器官聯系比較緊密，易于接收從各器官分泌的有變化的物質，但其應用于蛋白質組學并不是好的選擇。

尿液以各種形式收集血液在穩態機制下排出的廢物，匯集了大量的疾病相關變化，能夠更好地反映早期微小的變化，是biomarker研究的更好體液來源。接下來介紹兩篇應用案例，揭示尿液在biomarker研究中的重要貢獻，并提供了典型biomarker研究策略。

案例一

2022年05月19日，中國醫學科學院北京協和醫學院分子腫瘤學重要點實驗室孫玉琳團隊，聯合中國醫學科學院北京協和醫學院基礎醫學研究所孫偉團隊在國際知名期刊Nature Communications上聯合發表了題為“Noninvasive urinary protein signatures associated with colorectal cancer diagnosis and metastasis”的研究論文。該研究利用尿液蛋白質組學技術在大規模隊列中發現了可用于診斷和轉移風險預測的標志物組合，研究產生了高度準確的無創尿蛋白特征，并將改善尿蛋白質組學在未來結直腸癌（CRC）研究中的應用。

研究背景

結直腸癌（CRC）是全球第三大常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的二大原因。CRC的臨床診斷主要由區域淋巴結轉移（LNM）和遠處轉移（DM）定義，LNM和DM也是與CRC患者生存和復發直接相關的預后因素。目前臨床上基于影像學的單一監測策略不足以評估轉移和復發，在臨床上仍然迫切需要更準確和無創的生物標志物。尿液是發現早期和敏感生物標志物的來源，因為它可以迅速反映身體的變化。因此，尿液是生物標志物分析的良好樣本。

樣本選擇

共選用552例尿液樣本；其中健康組（HC）289例，無轉移瘤（NM）、淋巴結轉移（LNM）和遠處轉移（DM）的CRC患者共263例。

技術策略

TMT蛋白質組學、PRM蛋白質組學、定量點印跡分析、IHC分析

研究思路

研究結果

基于TMT定量蛋白質組學在四組中分別鑒定出2291，2642，3363和3181蛋白質。對4組995種常見蛋白進行無監督主成分分析（PCA），觀察HC與CRC不同分期患者之間的尿蛋白譜差異。結果表明HC和CRC組之間存在明顯差異（圖2a)。NM、LNM或DM和HC之間的成對差異尿蛋白采用平均倍數變化≥1.5的標準進行定義，分別鑒定出273、337和355個差異蛋白。IPA分析發現這些差異蛋白在腫瘤相關通路中顯著富集，包括腫瘤生長、腫瘤侵襲、免疫反應、代謝和信號傳導（RAC、FAK、CDC42和RhoA)途徑（圖2b-f）。

 圖1. 發現階段CRC的定量尿蛋白質組學分析

隨后研究人員采用靶向高通量蛋白質組學技術PRM來驗證差異尿蛋白。在發現階段鑒定的CRC相關和CRC轉移相關差異蛋白中，分別選擇了112和54種差異蛋白進行PRM驗證。其中41種差異蛋白其趨勢與TMT方法一致，包括18種下調和23種上調蛋白。接下來選擇14種相互依賴性較低的蛋白進行隨機森林分析確定診斷模型和轉移模型中重要的特征（圖3b）。同時使用ROC分析檢測每種蛋白質在診斷和轉移風險分層中的分類性能（圖3c)。建立了用于CRC診斷的尿蛋白標志物組合（CORO1C，ARPC5和RAD23B），以及用于CRC轉移風險預測的標志物組合（CORO1C，RAD23B，GSPT2和NDN）。

圖2. CRC尿蛋白生物標志物特征生成

為了驗證尿液特征以大規模區分HC和CRC患者，研究人員開發了一種基于尿液的定量點印跡檢測系統。通過每種蛋白質的標準曲線量化尿蛋白量，然后通過相應的尿肌酐測量值進行校準。進一步在434份尿液樣本中進行免疫學驗證，發現CRC患者尿液中CORO1C，ARPC5，RAD23B，GSPT2和NDN的濃度顯著高于HC的尿液（P <0.0001）。在三個CRC組中，這五種尿液蛋白的水平顯示出與疾病進展相關的梯度增加的趨勢，且在DM達到高水平（P<0.01）。

 圖3. 使用點印跡分析獨立驗證尿液蛋白特征

為了評估尿液中三種診斷相關蛋白（CORO1C、RAD23B和ARPC5）的異常改變是否來自CRC腫瘤組織，研究人員在幾個組織微陣列中進行了免疫組織化學染色測定。CORO1C和ARPC5定位于細胞質中，而RAD23B主要定位于細胞質和細胞核中。CRC腫瘤組織的CORO1C、RAD23B和ARPC5免疫染色陽性，與鄰近的非癌組織（所有P<0.0001）相比，表現出顯著上調。Kaplan–Meier生存分析表明，CORO1C和RAD23B在診斷和轉移特征上是共同的，高水平的CORO1C和RAD23B組織表達促進大腸癌中惡性細胞的轉移潛能，且與不良預后顯著相關。然而ARPC5在大腸癌中沒有預后意義。

圖4. 組織中三種診斷生物標志物的免疫組織化學染色及生存分析

小結

該研究利用尿液蛋白質組學方法，并結合discovery-verifification-validation的標志物研究策略，系統地分析了用于CRC診斷和預后的尿蛋白。該研究是目前為止在CRC中規模大、多方面的尿液生物標志物發現研究。尿液蛋白質組可以多方面反映不同CRC階段的病理生理變化，即使在CRC早期也是如此。該研究結果提供了有希望的尿蛋白生物標志物，可以可靠地診斷和檢測CRC，同時也表明了轉移性CRC的潛在介入靶點。由于只有少數早期CRC患者入組，因此需要進一步驗證檢測一等級CRC的診斷模型的準確性。還需要使用更大的隊列進行外部驗證，以概括結論。

案例二

2022年6月22日，北京師范大學高友鶴教授團隊在蛋白質組學期刊Clin Proteomics上在線發表了題為“Many kinds of oxidized proteins are present more in the urine of the elderly”的研究論文。該研究利用尿液蛋白質組學技術，表明了氧化蛋白存在于尿液中，并且老年人的氧化率高于年輕人。揭示了提高氧化蛋白在體內通過腎臟的排泄程度可能有助于維持身體內部環境的穩態，延緩衰老和老年性疾病的發生。

研究背景

近一個世紀以來，科學家們一直在不斷探索衰老的奧秘，并試圖找到減緩衰老的方法。一些研究發現，氧化應激會加劇衰老和與年齡相關的疾病。因此，防止氧化應激是介導長壽動物模型中觀察表型的常見手段。而尿液為許多疾病提供了另一種有前途的臨床可行基質，因為它可以頻繁且無創地大量收集，特別是提供診斷和預后機會。然而，只有少數PTM被應用于尿液生物標志物研究。該研究探索了尿蛋白修飾與衰老之間的關系。

樣本選擇

共收集38名健康個體的尿液樣本；其中包括兒童22例和老年人6例（RAW數據從已發表的研究下載），以及年輕組10例

技術策略

LFQ蛋白質組學（搜索不同修飾）

研究思路

研究結果

基于非標記定量蛋白質組學方法，在38個樣本中共鑒定出1480個修飾，這些修飾發生在蛋白質鏈中的20個氨基酸以及N和C末端。量化的修飾強度跨越了七個數量級，其中前十個豐富的蛋白質貢獻了整個修飾強度的百分之81-91（圖1c）。圖1d顯示了3個不同年齡的已識別修飾數，并且兒童、年輕和老年階段有變化的修飾之間的重疊是顯著的（圖1e，pvalue<0.05，FC>2或<0.5）。主成分分析顯示出不同年齡組的有效分離（圖1f-g）。此外根據每個年齡組每種修飾的比值（修飾位點數/肽段數）計算了不同氨基酸修飾的比例。結果發現，在脯氨酸（Pro，P）、色氨酸（Trp，W）、酪氨酸（Tyr，Y）、半胱氨酸（Cys，C）、亮氨酸（Leu，L）、苯丙氨酸（Phe，F）、纈氨酸（Val，V）和異亮氨酸（Ile，I）的非人工修飾中，氧化和氨基酸取代占主要地位，特別是在脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸中，老年組的氧化速率高于其他年齡組（圖1h）。

 圖1. 尿蛋白質組學中化學修飾的發現隊列總述

為了大限度地減少Open-search帶來的假陽性結果，對于所獲得的顯著表達的氧化修飾和AA取代，通過重復搜索識別進一步檢查這些修飾的真實性。通過計算發現11種氧化修飾和3種AA取代的表達隨年齡增長而顯著增加（圖2g）采用Wilcoxon秩和檢驗建立單個標志物的統計顯著性，并評價整個ROC曲線的顯著性。其中，4個氧化和1個AA取代的AUC>0.99（圖2j）。

 圖2. 發現隊列中的氧化和AA取代隨年齡的變化

為了驗證不同年齡組的氧化修飾，作者接下來收集了來自21-72歲個體的28個樣本，以重復上述實驗過程。在年輕、中年和老年組中存在7種差異表達的氧化，它們是潛在的衰老診斷標志物（圖3d）。7種差異表達的氧化所屬的蛋白中，骨橋蛋白（基因SPP1）的氧化位點在所有氧化蛋白中高。此外，作者還在喂養了27天、240天和600天7只雄性大鼠的尿液樣本中進一步驗證該結果。所有氧化修飾的無監督聚類分析顯示，老年大鼠可以和年輕和成年階段顯著區分開來。與其他組相比，老年大鼠的8種氧化差異，隨著年齡的增長幾乎呈線性增加（圖3e）。

圖3. 驗證隊列進行開放和重新搜索

小結

該研究發現一些修飾在老年人中高于年輕人，其中氧化占很大比例。這些修飾的蛋白質可能由于結構變化而從體內排出，導致功能喪失甚至對身體有害的影響。代謝或減少這些蛋白質的積累對于維持體內穩態甚至延緩衰老和衰老相關疾病可能具有重要意義。