單細胞蛋白質組學的研究是準確理解生物體的生長和發育以及疾病的發生和發展所必需的。然而，單細胞蛋白質組學的研究仍處于起步階段，部分原因是單細胞中的蛋白質種類多、豐度低、數量少、不可擴增性?；谫|譜（MS）的單細胞蛋白質組學在過去二十年中發展迅速，其特點包括樣品要求量低、靈敏度高、結構信息豐富以及不需要使用抗體進行標記。電噴霧電離質譜（ESI-MS）為單細胞蛋白質組學提供了高的蛋白質覆蓋率。然而，由于各種預處理方法、分離技術和MS儀器的可用性，單細胞蛋白質組學技術的樣品通量和覆蓋范圍可能有很大差異。

北京工業大學的汪夏燕教授團隊根據用于分離單細胞蛋白質樣品的不同方法對相關出版物進行了分類，介紹了檢測覆蓋率和通量方面的不同方法，并強調了提供重大突破和進步的技術；闡述了基于ESI-MS的單細胞蛋白質組學的應用和發展前景。

1：單細胞蛋白的初步檢測

Zhang等人在2015年提出了一種集成蛋白分析設備（iPAD），可以應用于100個細胞的蛋白質組分析（IPAD-100），乃至單細胞蛋白質分析（IPAD-1），單個HeLa細胞鑒定的蛋白質總數為328，檢測限約為1.7-170zmol。

Fang等人提出了毫升級油氣滴（OAD）芯片，該方法樣品損失小，樣品注入效率高（>99%），將該系統應用于單個HeLa細胞，鑒定出51種蛋白質；還使用該系統分析了單小鼠卵母細胞，并鑒定了355種蛋白質。與傳統的管內系統相比，該方法具有序列覆蓋率高、疏水蛋白和酶消化效率高的優點。

Zhu和Kelly等人描述了一種基于納米微滴的處理平臺（nanoPOTS）（圖1），通過該設備捕獲芯片上的納米微滴中單個細胞并進行裂解和蛋白消化。使用nanoLC-MS方法從單個CTC（LNCaP）細胞中總共檢測到167種蛋白質。隨后，結合熒光激活細胞分選（FACS）用于將單個細胞沉積到納米液滴樣品處理芯片中，配適超靈敏納米LC-MS進行分析，從單個HeLa細胞中鑒定出約670種蛋白質（平均）。此外，來自酶解離的人肺原代細胞的細胞類型可以被區分，并且通過該單細胞蛋白質組學平臺鑒定了間充質細胞和上皮細胞的特異性蛋白質標記物。

通過小化樣品預處理體積，開發了一種減少單細胞蛋白質樣品吸附的方法，以進一步減少樣品的損失。Shi等開發了一種表面活性劑輔助的樣品制備方案（圖2）：SOP-MS方法將MS兼容的n-十二烷基-β-D麥芽糖苷與疏水表面基質離心管或多孔板結合，用于樣品制備。該方法消除了所有樣品轉移步驟，并使有效單細胞處理的表面吸附損失小化，從而提高了檢測靈敏度。實現了來自小組織切片（接近20個細胞）的1200個蛋白質的無標記定量；將該方法應用于單細胞分辨率患者的CTC衍生異種移植物（PCDX）模型中，揭示了早期轉移肺細胞和原代腫瘤細胞中不同的蛋白質特征。

為了減少樣品吸附和損失，縮短處理時間，Kitamori等報告了一種集成的納米流體芯片裝置，用于在毫微微升（fL-pL）范圍內操縱樣品以進行高通量分析（圖3）。該裝置適用于胰蛋白酶水解、色譜分離和無標記檢測，本研究使用了紫外檢測，預計ESI-MS與該裝置結合將在未來用于單細胞蛋白質組學分析。

圖3 用于單細胞蛋白質組學分析的集成納米流體微陣列裝置示意圖

2008年，Audet等人提出了一種利用超聲剪切細胞并在細胞表面產生局部高壓超快裂解單細胞的方法，該技術平均需要50秒才能裂解單個細胞；當細胞在超聲處理前用弱洗滌劑（如洋地黃苷）處理時，細胞裂解時間可縮短至3秒。Kitamori等人開發的集成納米流體芯片裝置發現，在納米通道中，12小時的大量消化色譜圖與15分鐘的消化色譜圖相似，表明兩種條件達到了相似的消化狀態。

Zhu和Kelly等人將微流體芯片平臺、單細胞自動分選和自動樣品注射結合到單細胞預處理過程中（圖6）以加快單細胞蛋白預處理速度。每個芯片允許快速分析243個單細胞。

單細胞蛋白質組學測量的靈敏度隨著低流量分離（<100nL/min）而提高，但樣品加載、柱清潔和再生所需的時間導致低通量和MS的低效利用，Kelly等人開發了雙柱液相色譜（LC）系統（圖7），該系統使用兩個并行子系統進行樣品加載、在線脫鹽、分析和柱再生，從而大大提高了無標記單細胞蛋白質組的產量。作為兩個柱交替處理的結果，高通量LC系統可重復使用。在單個HeLa細胞的分析中，當周期為30min時，每個細胞中可鑒定出近1000個蛋白質，當周期時間為15min時，每細胞可鑒定出660個蛋白質。

圖6 nanoPOTS（N2）芯片的設計和操作原理圖

4：其他分離手段-毛細管電泳

單細胞蛋白質樣品也可以通過毛細管電泳（CE）分離。CE中通常使用兩種樣本采集方法，一種是從組織中分離單個細胞；另一種是使用移液管從單細胞微區吸取樣本。Sweedler等人建立了CE-TIMS MS方法，以探索單細胞水平上的肽立體化學（圖9），通過CE和MS對單個細胞的肽含量進行了表征。

Nemes等人使用光學引導的原位亞細胞毛細管微取樣的方法對活脊椎動物胚胎進行采樣，結合蛋白提取消化、毛細管分離肽、超靈敏納米電噴霧電離和高分辨率MS檢測，從5ng蛋白質樣品中鑒定和定量了約750-800個蛋白質（圖10）。

不過CE更適合分離大體積、蛋白質含量更多的胚胎、卵母細胞或神經元，與LC分離相比，分離效率低、重復性差，容易受到溫度和pH等影響，所以尚未在單細胞蛋白質組學研究中得到廣泛的應用。