二硫鍵（Disulfide bond）是多肽和蛋白質中常見的一種翻譯后修飾，是指氨基酸序列內2個半胱氨酸殘基（—SH）發生氧化反應失去兩個氫（—H）而形成的共價鍵鍵橋。二硫鍵的存在對于維持多肽的結構和功能具有重要作用。二硫鍵不僅賦予了多肽多種多樣的生物活性，而且使多肽結構被鎖定具有強的化學穩定性、酶穩定性、熱穩定性等。

技術介紹

用含有NEM巰基封閉劑的蛋白提取液提取樣本中的蛋白，經過TCA/丙酮沉淀純化后，用不同的酶（組合）在適當條件下剪切成肽段。經過液相質譜聯用儀采集數據后用pLINK-SS進行分析鑒定。

實驗流程圖

應用方向

基礎醫學、臨床診斷：生物標志物的篩選，發病機制，靶向載體構建及治療等生物醫藥：藥物作用機理，藥效評價等

微生物領域：菌株等生物體改造，靶向重組蛋白研發等

業生產及食品營養農：作物品種質量優化，食品品質及質地改良，食品安全檢測等

二硫鍵蛋白組學案例解析

在蛋白質水平上鑒定天然二硫鍵

Mapping native disulfide bonds at a proteome sale

研究對象：Simple samples(RNaseA 、小鼠抗DAF-16單克隆抗體、一個10種等質

期刊：Nature Methods

影響因子：30.822

發表單位：北京師范大學生命科學學院

研究背景

長期以來人們一直不能直接在細胞內觀察二硫鍵的形成，有關二硫鍵蛋白質組的形成與細胞功能關系的研究領域進展緩慢。以往的蛋白質二硫鍵定位方法，例如點突變、分步還原加差異烷基化處理、依賴手工解譜的質譜方法等等，不僅繁瑣耗時，靈敏度低，而且僅適用于單個純化蛋白。

在這篇論文中，作者開發了兩套分別適用于簡單樣品和復雜樣品中定位解離天然二硫鍵的酶解方法，以及配套的二硫鍵鑒定軟件pLINK-SS的搜庫結果。

研究策略

結果速遞

形成二硫鍵的半胱氨酸殘基之間的距離分析

蛋白中天然二硫鍵的位置對于生物體來說也是至關重要的。由于氨基酸序列某個位點的突變將會導致蛋白生物功能發生改變，然而分子間的二硫鍵的形成會增強蛋白的穩定性。本研究通過pLINK-SS鑒定及定位到許多涉及催化或與金屬結合的半胱氨酸殘基的調節性二硫鍵。分析E.coli周質及人體細胞中兩個形成二硫鍵的半胱氨酸殘基之間的距離，表明CXXC型最多。

隨著分子生物學的發展，成熟的質譜技術也逐漸應用到二硫鍵的定位研究中，先將完整的蛋白質或多肽進行酶解成含有不同信息的肽段，經過質譜檢測各個肽段的具體信息后，通過pLINK-SS對二硫鍵的配對方式進行表征，可以更好地研究生物中天然的蛋白信息，為其結構和功能提供依據。

圖1 形成二硫鍵的半胱氨酸殘基之間的距離分析

不同樣品經pLINK搜庫二硫鍵數目結果

文章對一些簡單樣本通過不同的酶組合進行處理，經pLINK搜庫后鑒定到的二硫鍵數目。圖1-A表示：使用不同蛋白酶（組合）在E.coli周質組份中鑒定的二硫鍵數目（括號中紅色數字表示用該酶（組合）唯一標識到的數量）；圖1-B表示：使用不同的蛋白酶（組合）在10中標準蛋白混合物中到的二硫鍵數目。

圖2 pLINK搜庫后鑒定到的二硫鍵數目

pLINK搜庫二硫鍵定位結果

不同的樣品中天然二硫鍵常常存在三種交聯方式，相互交聯（圖2-a）、環交聯（圖2-b）、兩個或多個二硫鍵交聯（圖2 -c）。

圖3  pLINK搜庫后鑒定到的二硫鍵位置

參考文獻

Lu S, Fan SB, Yang B, Li YX, et al.. Mapping native disulfide bonds at a proteome scale. Nat Methods. 2015 Apr;12(4):329-31. doi: 10.1038/nmeth.3283. Epub 2015 Feb 9. PMID: 25664544.